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Charles Barkla begann nach dem Besuch des Liverpool Institutes 1894 mit dem Studium der Mathematik und Physik am University College Liverpool, damals Teil der Victoria University. Nach dem Abschluss in Physik 1898 wurde er 1899 promoviert und erhielt ein Forschungsstipendium am Cavendish-Laboratorium des Trinity College in Cambridge. Er wechselte allerdings bereits ein Jahr später an das King’s College und kehrte 1902 nach Liverpool zurück. Er übernahm 1909 eine Professur für Physik an der Universität London und wechselte 1913 an den Lehrstuhl für Naturphilosophie an der Universität Edinburgh, den er bis zu seinem Tod innehatte.

Barkla heiratete 1907 Mary Esther Cowell und hatte zwei Söhne und eine Tochter. Nach ihm ist der Mondkrater Barkla benannt.